Регистрация активности единичных молекул аспарагиназы с помощью нанопорового детектора

Цель. Изучить возможность использования нанопор для мониторинга функционирования аспарагиназы.

Процедура и методы. В работе была сконструирована нанопора на базе SiN, в которую встраивали молекулу L-аспарагиназы. Мониторинг каталитической активности встроенной в нанопору единичной молекулы L-аспарагиназы осуществляли, наблюдая за изменением ионного тока в ячейке с этой нанопорой. Этот подход полезен для исследования каталитической активности на базе встроенных в нанопору единичных молекул ферментов.

Результаты. Был создан нанопоровый детектор для исследования активности аспарагиназы. Было получено, что этот детектор позволял проводить мониторинг активности этого фермента в реальном времени без использования меток.

Теоретическая и/или практическая значимость. Показано, что нанопоровый детектор, с размером нанопоры порядка 6 нм, может быть использован для исследования активности аспарагиназы. При этом возможно проводить в реальном времени контроль изменения формы аспарагиназы, который заключается в контроле изменения тока проводимости, проходящего через нанопору, в котором была иммобилизована аспарагиназа. Полученные результаты могут быть полезны при анализе работы ферментов на уровне единичных молекул с помощью нанопорового детектора.

1. L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent / Verma N., Kumar K., Kaur G., Anand S. // Critical reviews in biotechnology. 2007. Vol. 27. Iss. 1. P. 45–62. DOI: 10.1080/07388550601173926.

2. L-asparaginase / Whitecar J. P. Jr, Bodey G. P., Harris J. E., Freireich E. J. // The New England Journal of Medicine. 1970. Vol. 282. No. 13. P. 732–734. DOI: 10.1056/NEJM197003262821307.

3. Kozak M., Jurga S. A comparison between the crystal and solution structures of Escherichia coli asparaginase II // Acta Biochimica Polonica. 2002. Vol. 49. No. 2. P. 509–513.

4. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy / Swain A. L., Jaskólski M, Housset D, Rao J. K, Wlodawer A. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1993. Vol. 90. no. 4. P. 1474–1478. DOI: 10.1073/pnas.90.4.1474.

5. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: Crystal structure of a Thr‐89‐Val mutant / Palm G. J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Röhm K. H., Wlodawer A. // FEBS Letters. 1996. Vol. 390. No. 2. P. 211–216. DOI: 10.1016/0014-5793(96)00660-6.

6. Исследование вторичной структуры L-аспарагиназы в широком интервале значений рН / Илларионова И. Г., Петров Л. И., Олейникова Л. В., Рощин С. Н., Пасечник В. А., Халяпин Б. Д., Полоцкий А. Е., Воинова Н. Е., Штукина Т. Б. // Молекулярная Биология. 1980. Т. 14. № 4. С. 951–955.

7. АСМ-визуализация, измерение активности и физико-химических свойств единичных мономеров и олигомеров ферментов / Иванов Ю. Д. Бухарина Н. С., Плешакова Т. О., Французов П. А., Крохин Н. В., Зиборов В. С., Арчаков А. И. // Биофизика. 2011. Т. 56. № 5. С. 939–944.

8. АСН-нанотехнология для визуализации, счёта, определения упругости и активности единичных белков цитохром Р 450-содержащих монооксигеназных систем / Иванов Ю. Д., Бухарина Н. С., Французов П. А., Плешакова Т. О., Мунро А. В., Хуэй Бон Хоа Г., Арчаков А. И. // Нанотехнологии и охрана здоровья. 2010. Т. 2. № 1. С. 30– 35.

9. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope / Radmacher M., Fritz M., Hansma H. G., Hansma P. K. // Science. 1994. Vol. 265. No. 5178. P. 1577–1579. DOI: 10.1126/science.8079171.

10. A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates / Pham B., Eron S. J., Hill M. E., Li X., Fahie M. A., Hardy J. A., Chen M. // Biophysical Journal. 2019. Vol. 117. No. 5. P. 844–855. DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.045.

11. Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis / Wang L., Han Y., Zhou S., Guan X. // Biosensors and Bioelectronics. 2014. Vol. 62. P. 158– 162. DOI: 10.1016/j.bios.2014.06.041.

12. Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity / Zhou S., Wang L., Chen X, Guan X. // ACS Sensors. 2016. Vol. 1. No. 5. P. 607–613. DOI: 10.1021/acssensors.6b00043.

13. Kukwikila M., Howorka S. Nanopore-based electrical and label-free sensing of enzyme activity in blood serum // Analytical Chemistry. 2015. Vol. 87. No. 18. P. 9149–9154. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b01764.

14. Translocation of double-stranded DNA through membrane-adapted phi29 motor protein nanopores / Wendell D., Jing P., Geng J., Subramaniam V., Lee T. J., Montemagno C., Guo P. // Nature Nanotechnology. 2009. Vol. 4. No. 11. P. 765–772. DOI: 10.1038/nnano.2009.259.

15. An engineered ClyA nanopore detects folded target proteins by selective external association and pore entry / Soskine M., Biesemans A., Moeyaert B., Cheley S., Bayley H., Maglia G. // Nano letters. 2012. Vol. 12. No. 9. P. 4895–4900. DOI: 10.1021/nl3024438.

16. Ion-beam sculpting at nanometre length scales / Li J., Stein D., McMullan C., Branton D. Aziz M. J., Golovchenko J. A. // Nature. 2001. Vol. 412. No. 6843. P. 166–169. DOI: 10.1038/35084037.

17. Kwok H., Briggs K., Tabard-Cossa V. Nanopore fabrication by controlled dielectric breakdown // PLOS ONE. 2014. Vol. 9. Iss. 3. P. e92880. DOI: 10.1371/journal.pone.0092880.

18. Solid-state nanopore fabrication by automated controlled breakdown / Waugh M., Briggs K., Gunn D., Gibeault M., King S., Ingram Q., Jimenez A. M., Berryman S., Lomovtsev D., Andrzejewski L., Tabard-Cossa V. // Nature Protocols. 2020. Vol. 15. No. 1. P. 122–143. DOI: 10.1038/s41596-019-0255-2.

19. Ionic field effect transistors with sub-10 nm multiple nanopores / Nam S.-W., Rooks M. J., Kim K.-B., Rossnagel S. M. // Nano letters. 2009. Vol. 9. No. 5. P. 2044–2048. DOI: 10.1021/nl900309s.

20. Structural and functional insights into Erwinia carotovora l‐asparaginase / Papageorgiou A. C., Posypanova G. A., Andersson C. S., Sokolov N. N., Krasotkina J. // The FEBS Journal. 2008. Vol. 275. Iss. 17. P. 4306–4316.