phmathВестник Государственного университета просвещения. Серия: Физика-МатематикаBulletin of Federal State University of Education. Series: Physics and Mathematics2949-50832949-5067Federal State University of Education10.18384/2949-5067-2025-1-40-51phmath-661Research ArticleФИЗИКАPHYSICSИспользование искусственных твердотельных пор для измерения каталитической активности отдельных молекул пероксидазы хренаThe use of artificial solid-state pores for measurement of catalytic activity of individual molecules of horseradish peroxidasehttps://orcid.org/0000-0001-5041-1914ИвановЮ. Д.IvanovYu. D.

Иванов Юрий Дмитриевич – доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией нанобиотехнологии; ведущий научный сотрудник лаборатории № 6.2. – ударно-волновых воздействий

г. Москва

Yuri D. Ivanov – Dr. Sci. (Biology), Prof., Laboratory Head, Laboratory of Nanobiotechnology; Leading Researcher, Laboratory No. 6.2. – Shock wave impacts

Moscow

yurii.ivanov.nata@gmail.comhttps://orcid.org/0009-0004-3096-107XАблеевА. Н.AbleevA. N.

Аблеев Александр Нариманович – ведущий инженер лаборатории нанобиотехнологии

г. Москва

Alexander N. Ableev  – Leading Engineer, Laboratory of Nanobiotechnology

Moscow

ableev@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-1509-7218ШумянцеваВ. В.ShumyantsevaV. V.

Шумянцева Виктория Васильевна – доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биоэлектрохимии

г. Москва

Victoria V. Shumyantseva – Dr. Sci. (Biology), Prof., Laboratory Head, Laboratory of Bioelectrochemistry

Moscow

v_shumyantseva@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-9795-7065ШумовИ. Д.ShumovI. D.

Шумов Иван Дмитриевич – кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии 

г. Москва

Ivan D. Shumov – Cand. Sci. (Biology), Researcher, Laboratory of Nanobiotechnology

Moscow

shum230988@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7942-3337ЗиборовВ. С.ZiborovV. S.

Зиборов Вадим Серафимович – кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории № 6.2. – ударно-волновых воздействий; ведущий специалист лаборатории нанобиотехнологии 

г. Москва

Vadim S. Ziborov – Cand. Sci. (Phys.-Math.), Senior Researcher, Laboratory No. 6.2. – shock wave impacts; Leading Specialist, Laboratory of Nanobiotechnology

Moscow

ziborov.vs@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2767-2299НеведроваЕ. Д.NevedrovaE. D.

Неведрова Екатерина Дмитриевна  – младший научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии 

г. Москва

Ekaterina D. Nevedrova  – Research Assistant, Laboratory of Nanobiotechnology

Moscow

nevedrova.kat@yandex.ruhttps://orcid.org/0009-0001-6044-3490ВиноградоваА. В.VinogradovaA. V.

Виноградова Ангелина Владимировна – младший научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии 

г. Москва

Angelina V. Vinogradova – Research Assistant, Laboratory of Nanobiotechnology

Moscow

angeluna1234@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2103-2998ИвановаИ. А.IvanovaI. A.

Иванова Ирина Александровна – младший научный сотрудник лаборатории исследований единичных биомакромолекул 

г. Москва

Irina A. Ivanova – Research Assistant, Laboratory for Research of Single Biomacromolecules

Moscow

i.a.ivanova@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6080-0729ВаулинН. В.VaulinN. V.

Ваулин Никита Васильевич – лаборант лаборатории возобновляемых источников энергии 

г. Санкт-Петербург

Nikita V. Vaulin – Laboratory Assistant, Laboratory for Renewable Energy Sources

Saint-Petersburg

nikitavaylin@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5389-2899ЛебедевД. В.LebedevD. V.

Лебедев Денис Владимирович – кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории возобновляемых источников энергии 

г. Санкт-Петербург

Denis V. Lebedev – Cand. Sci. (Phys.-Math.), Senior Researcher, Laboratory for Renewable Energy Sources 

Saint-Petersburg

denis.v.lebedev@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5459-1438БукатинА. С.BukatinA. S.

Букатин Антон Сергеевич – кандидат физико-математических наук, доцент, старший научный сотрудник лаборатории возобновляемых источников энергии

г. Санкт-Петербург

Anton S. Bukatin – Cand. Sci. (Phys.-Math.), Assoc. Prof., Senior Researcher, Laboratory for Renewable Energy Sources

Saint-Petersburg

antbuk.fiztek@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0001-9792-045XМухинИ. С.MukhinI. S.

Мухин Иван Сергеевич – доктор физико-математических наук, профессор, заведующий лабораторией возобновляемых источников энергии

г. Санкт-Петербург

Ivan S. Mukhin – Dr. Sci. (Phys.-Math.), Prof., Laboratory Head, Laboratory for Renewable Energy Sources

Saint-Petersburg

imukhin@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-2362-023XСараеваИ. Н.SaraevaI. N.

Сараева Ирина Николаевна – кандидат физико-математических наук, научный сотрудник лаборатории лазерной нанофизики и биомедицины отделения квантовой радиофизики им. Н. Г. Басова

г. Москва

Irina N. Saraeva – Cand. Sci. (Phys.-Math.), Researcher, Laboratory for Laser Nanophysics and Biomedicine, Department of Quantum Radiophysics named after N. G. Basov

Moscow

saraevain@lebedev.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1259-163XАпельП. Ю.ApelP. Y.

Апель Павел Юрьевич – доктор химических наук, начальник Центра прикладной физики Лаборатории ядерных реакций им. Г. Н. Флерова 

г. Дубна, Московская обл.

Pavel Yu. Apel – Dr. Sci. (Chemistry), Head of the Center for Applied Physics, Flerov Laboratory of Nuclear Reactions

Dubna, Moscow Region

apel@jinr.ruhttps://orcid.org/0009-0002-9161-0877ЮшковЕ. С.YushkovE. S.

Юшков Евгений Семенович – кандидат технических наук, доцент кафедры № 71 «Экономика и менеджмент в промышленности» 

г. Москва

Evgeniy S. Yushkov – Cand. Sci. (Engineering), Assoc. Prof., Department No. 71 “Economics and Management in Industry”

Moscow

esyushkov@mephi.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2290-8090АрчаковА. И.ArchakovA. I.

Арчаков Александр Иванович – доктор биологических наук, профессор, научный руководитель

г. Москва

Alexander I. Archakov – Dr. Sci. (Biology), Prof., Scientific Leader

Moscow

archak@ibmc.msk.ruНаучно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича; Объединенный институт высоких температур Российской академии наукРоссияInstitute of Biomedical Chemistry; Joint Institute for High Temperatures of the Russian Academy of SciencesRussian FederationНаучно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. ОреховичаРоссияInstitute of Biomedical ChemistryRussian FederationСанкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж. И. Алфёрова Российской академии наукРоссияAlferov Federal State Budgetary Institution of Higher Education and Science Saint Petersburg National Research Academic University of the Russian Academy of SciencesRussian FederationФизический институт им. П. Н. Лебедева Российской академии наукРоссияР. N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of SciencesRussian FederationОбъединенный институт ядерных исследованийРоссияJoint Institute for Nuclear ResearchRussian FederationНациональный исследовательский ядерный университет «МИФИ»РоссияNational Research Nuclear University MEPhIRussian Federation202514072025014051Copyright © Иванов Ю.Д., Аблеев А.Н., Шумянцева В.В., Шумов И.Д., Зиборов В.С., Неведрова Е.Д., Виноградова А.В., Иванова И.А., Ваулин Н.В., Лебедев Д.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Сараева И.Н., Апель П.Ю., Юшков Е.С., Арчаков А.И., 20252025Иванов Ю.Д., Аблеев А.Н., Шумянцева В.В., Шумов И.Д., Зиборов В.С., Неведрова Е.Д., Виноградова А.В., Иванова И.А., Ваулин Н.В., Лебедев Д.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Сараева И.Н., Апель П.Ю., Юшков Е.С., Арчаков А.И.Ivanov Y.D., Ableev A.N., Shumyantseva V.V., Shumov I.D., Ziborov V.S., Nevedrova E.D., Vinogradova A.V., Ivanova I.A., Vaulin N.V., Lebedev D.V., Bukatin A.S., Mukhin I.S., Saraeva I.N., Apel P.Y., Yushkov E.S., Archakov A.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.physmathmgou.ru/jour/article/view/661Цель

Цель. Определение каталитической активности единичной молекулы пероксидазы хрена (ПХ) в реакции окисления субстрата 2,2'-азино-бис-[3-этилбензтиазолин-6-сульфоната] (АБТС) пероксидом водорода.

Процедура и методы

Процедура и методы. Для определения (мониторинга) каталитической активности ПХ использовали поровую технологию, что позволило провести анализ активности единичной молекулы ПХ без введения в систему дополнительных компонентов для усиления сигнала. Для этого использовали твёрдотельную пору размером около 5 нм, сформированную методом электронно-лучевого сверления в пластине нитрида кремния толщиной ~40 нм. Молекула ПХ была встроена в эту пору, после чего проводили анализ каталитической активности встроенной в пору молекулы, в присутствии АБТС и H2O2 путём измерения ионного тока, протекающего через пору со встроенной в неё молекулой ПХ.

Результаты

Результаты. Мониторинг каталитической активности ПХ в реакции окисления АБТС был проведён путём регистрации ионного тока, протекающего через пору.

Теоретическая и/или практическая значимость. Было показано, что изготовленная пора может быть использована для мониторинга каталитической активности ПХ. Полученные результаты важны для развития работ в области исследования ферментов на уровне единичных молекул.

Aim

Aim. Determination of the catalytic activity of a single molecule of horseradish peroxidase (HRP) in the oxidation reaction of the substrate 2,2ʹ-azino-bis-[3-ethylbenzthiazoline-6- sulfonate] (ABTS) with hydrogen peroxide.

Methodology

Methodology. To determine (monitor) the catalytic activity of HRP, pore technology has been used; it has allowed us to analyze the activity of a single HRP molecule without introducing additional components into the system to enhance the signal. For this purpose, a solid-state pore of about 5 nm in size, formed by electron-beam drilling in a silicon nitride plate of ~40 nm thickness, has been used. A HRP molecule has been embedded in this pore, after which the catalytic activity of the molecule embedded in the pore in the presence of ABTS and H2O2 has been analyzed by measuring the ion current through the pore with the HRP molecule embedded in it.

Results

Results. A pore detector has been proposed to study the catalytic activity of HRP in the reaction of ABTS oxidation. It has been found that this detector made it possible to monitor the activity of this enzyme by registering of ion current through the pore.

Research implications

Research implications. It has been shown that the manufactured pore can be used to monitor HRP activity. The results obtained are important for the development of work in the field of enzyme research at the level of single molecules.

каталитическая активностьпероксидаза хренаферментenzymehorseradish peroxidasecatalytic activityЭксперименты по определению активности фермента выполнены в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№ 122030100168-2). Авторы выражают благодарность ОИВТ РАН за подготовку образцов. Работа по подготовке образцов была выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (Государственное задание № 075-00269-25-00).The experiments on determination of the enzyme activity were performed within the framework of the Program for Basic Research in the Russian Federation for a longterm period (2021-2030) (No. 122030100168-2). The authors express their gratitude to Joint Institute for High Temperatures of the Russian Academy of Sciences for sample preparation. The work on sample preparation was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (State Assignment No. 075-00269-25-00).ReferencesАСМ-визуализация, измерение активности и физико-химических свойств единичных мономеров и олигомеров ферментов / Ю. Д. Иванов, Н. C. Буxаpина, Т. О. Плешакова, П. А. Фpанцузов, Н. В. Кpоxин, В. C. Зибоpов, А. И. Аpчаков // Биофизика. 2011. Т. 56. № 5. С. 939–944.Ivanov, Y. D., Bukharina, N. S., Pleshakova, T. O., Frantsuzov, P. A., Krokhin, N. V., Ziborov, V. S. & Archakov, A. I. (2011). Atomic force microscopy visualization and measurement of the activity and physicochemical properties of single monomeric and oligomeric enzymes. In: Biophysics, 56 (5), 939–944 (in Russ.).АСН-нанотехнология для визуализации, счёта, определения упругости и активности единичных белков цитохром Р 450-содержащих монооксигеназных систем / Ю. Д. Иванов, Н. С. Бухарина, П. А. Французов, Т. О. Плешакова, А. В. Мунро, Г. Хуэй Бон Хоа, А. И. Арчаков // Нанотехнологии и охрана здоровья. 2010. Т. 2. № 1. С. 30–35.Ivanov, Y. D., Bukharina, N. S., Frantsuzov, P. A., Pleshakova, T. O., Munro, A. V., Hui Bon Hoa, G. & Archakov, A. I. (2010). ASN-nanotechnology for visualization, counting, determination of elasticity and activity of single proteins of cytochrome P 450-containing monooxygenase systems. In: Nanotechnology and Health Protection, 2 (1), 30–35 (in Russ.).Direct Observation of enzyme activity with the atomic force microscope / M. Radmacher, M. Fritz, H. G. Hansma, P. K. Hansma // Science. 1994. Vol. 265. Iss. 5178. P. 1577–1579. DOI: 10.1126/science.8079171.Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, H. G. & Hansma, P. K. (1994). Direct Observation of enzyme activity with the atomic force microscope. In: Science, 265 (5178), 1577–1579. DOI: 10.1126/science.8079171.Measuring enzymatic activities with nanopores / Y. Sheng, S. Zhang, L. Liu, H.-C. Wu // ChemBioChem. 2020. Vol. 21. Iss. 15. P. 2089–2097. DOI: 10.1002/cbic.202000079.Sheng, Y., Zhang, S., Liu, L. & Wu, H.-C. (2020). Measuring enzymatic activities with nanopores. In: ChemBioChem, 21 (15), 2089–2097. DOI: 10.1002/cbic.202000079.Nanopore-based measurement of the interaction of P450cam monooxygenase and putidaredoxin at the single-molecule level / H. Chen, Y. Lin, Y.-T. Long, S. D. Minteer, Y.-L. Ying // Faraday Discussions. 2022. Vol. 233. P. 295–302. DOI: 10.1039/d1fd00042j.Chen, H., Lin, Y., Long, Y.-T., Minteer, S. D. & Ying, Y.-L. (2022). Nanopore-based measurement of the interaction of P450cam monooxygenase and putidaredoxin at the single-molecule level. In: Faraday Discussions, 233, 295–302. DOI: 10.1039/d1fd00042j.Single-molecule nanopore enzymology / K. Willems, V. van Meervelt, C. Wloka, G. Maglia // Philosophical transactions of the Royal Society B, Biological sciences. 2017. Vol. 372. Iss. 1726. Article no. 20160230. DOI: 10.1098/rstb.2016.0230.Willems, K., van Meervelt, V., Wloka, C. & Maglia, G. (2017). Single-molecule nanopore enzymology. In: Philosophical transactions of the Royal Society B, Biological sciences, 372 (1726), 20160230. DOI: 10.1098/rstb.2016.0230.Label-free and real-time detection of protein ubiquitination with a biological nanopore / C. Wloka, V. van Meervelt, D. V. Gelder, N. Danda, N. Jager, C. P. Williams, G. Maglia // ACS Nano. 2017. Vol. 11. Iss. 5. P. 4387–4394. DOI: 10.1021/acsnano.6b07760.Wloka, C., van Meervelt, V., Gelder, D. V., Danda, N., Jager, N., Williams, C. P. & Maglia, G. (2017). Label-free and real-time detection of protein ubiquitination with a biological nanopore. In: ACS Nano, 11 (5), 4387–4394. DOI: 10.1021/acsnano.6b07760.A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates / B. Pham, S. J. Eron, M. E. Hill, Xin Li, M. A. Fahie, J. A. Hardy, Min Chen // Biophysical Journal. 2019. Vol. 117. Iss. 5. P. 844–855. DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.045.Pham, B., Eron, S. J., Hill, M. E., Xin, Li, Fahie, M. A., Hardy, J. A. & Chen, Min (2019). A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates. In: Biophysical Journal, 117 (5), 844–855. DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.045.A selective activity-based approach for analysis of enzymes with an OmpG nanopore / M. A. Fahie, B. Pham, F. Li, M. Chen // Methods in Molecular Biology. 2021. Vol. 2186. P. 115–133. DOI: 10.1007/978-1-0716-0806-7_9.Fahie, M. A., Pham, B., Li, F. & Chen, M. (2021). A selective activity-based approach for analysis of enzymes with an OmpG nanopore. In: Methods in Molecular Biology, 2186, 115–133. DOI: 10.1007/978-1-0716-0806-7_9.Рогожин В. В., Кутузова Г. Д., Угарова Н. Н. Ингибирование пероксидазы хрена N-этиламидом о-сульфобензоилуксусной кислоты // Биоорганическая химия. 2000. Т. 26. № 2. С. 156–160.Rogozhin, V. V., Kutuzova, G. D. & Ugarova, N. N. (2000). Inhibition of horseradish peroxidase by W-ethylamide of o-sulfobenzoylacetic acid. In: Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 26 (2), 156–160 (in Russ.).Davies P. F., Rennke H. G., Cotran, R. S. Influence of molecular charge upon the endocytosis and intracellular fate of peroxidase activity in cultured arterial endothelium // Journal of Cell Science. 1981. Vol. 49. Iss. 1. P. 69–86. DOI: 10.1242/jcs.49.1.69.Davies, P. F., Rennke, H. G. & Cotran R. S. (1981). Influence of molecular charge upon the endocytosis and intracellular fate of peroxidase activity in cultured arterial endothelium. In: Journal of Cell Science, 49 (1), 69–86. DOI: 10.1242/jcs.49.1.69.Sander S. A., Bray R. C., Smith A. T. pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine // European Journal of Biochemistry. 1994. Vol. 224. Iss. 3. P. 1029–1037. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x.Sander, S. A., Bray, R. C. & Smith, A. T. (1994). pH-dependent properties of a mutant horseradish peroxidase isoenzyme C in which Arg38 has been replaced with lysine. In: European Journal of Biochemistry, 224 (3), 1029–1037. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1994.01029.x.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.