phmathВестник Государственного университета просвещения. Серия: Физика-МатематикаBulletin of Federal State University of Education. Series: Physics and Mathematics2949-50832949-5067Federal State University of Education10.18384/2949-5067-2024-1-20-32phmath-620Research ArticleФИЗИКАPHYSICSРегистрация активности единичных молекул аспарагиназы с помощью нанопорового детектораRegistration of asparaginase single molecule activity using a nanopore detectorИвановЮ. Д.IvanovYu.

Иванов Юрий Дмитриевич – доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией нанобиотехнологии ; ведущий научный сотрудниклаборатории № 6.2. – ударно-волновых воздействий

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8; 125412, г. Москва, ул. Ижорская, д. 13, стр. 2

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121; ulitsa Izhorskaya 13, Moscow 125412 

Yurii.ivanov.nata@gmail.comАблеевА. Н.AbleevA.

Аблеев Александр Нарманович – ведущий инженер лаборатории нанобиотехнологии

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

ableev@mail.ruШумянцеваВ. В.ShumyantsevaV.

Шумянцева Виктория Васильевна – доктор биологических наук, профессор, заведующийлабораторией биоэлектрохимии 

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

ЖдановД. Д.ZhdanovD.

Жданов Дмитрий Дмитриевич – доктор биологических наук, профессор, заведующийлабораторией медицинской биотехнологии 

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

ПокровскаяМ. В.PokrovskayaM.

Покровская Марина Владимировна – кандидат биологических наук, ведущий научныйсотрудник лаборатории медицинской биотехнологии

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

АлександроваС. С.AleksandrovaS.

Александрова Светлана Серебеджановна – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

ИвановаИ. А.IvanovaI.

Иванова Ирина Александровна – младший научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

ВиноградоваА. В.VinogradovaA.

Виноградова Ангелина Владимировна – младший научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

НеведроваЕ. Д.NevedrovaE.

Неведрова Екатерина Дмитриевна – младший научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии 

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

ЗиборовВ. С.ZiborovV.

Зиборов Вадим Серафимович – кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории № 6.2. – ударно-волновых воздействий ; ведущий специалист лаборатории нанобиотехнологии

119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8; 125412, г. Москва, ул. Ижорская, д. 13, стр. 2

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121; ulitsa Izhorskaya 13, Moscow 125412 

ВаулинН. В.VaulinN.

Ваулин Никита Васильевич – аспирант по направлению «Физика полупроводников», лаборант лаборатории возобновляемых источников энергии

194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 8, корп. 3, литер А

ulitsa Khlopina 8 build. 3 letter A, St. Petersburg 194021

ЛебедевД. В.LebedevD.

Лебедев Денис Владимирович – кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории возобновляемых источников энергии

194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 8, корп. 3, литер А

ulitsa Khlopina 8 build. 3 letter A, St. Petersburg 194021

БукатинА. С.BukatinA.

Букатин Антон Сергеевич – кандидат физико-математических наук, доцент кафедры нанобиотехнологий, старший научный сотрудник лаборатории возобновляемых источников энергии 

194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 8, корп. 3, литер А

ulitsa Khlopina 8 build. 3 letter A, St. Petersburg 194021

МухинИ. С.MukhinI.

Мухин Иван Сергеевич – доктор физико-математических наук, профессор, заведующийлабораторией возобновляемых источников энергии

194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 8, корп. 3, литер А

ulitsa Khlopina 8 build. 3 letter A, St. Petersburg 194021

АрчаковА. И.ArchakovA.

Арчаков Александр Иванович – Академик РАН, доктор биологических наук, профессор, научный руководитель

194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 8, корп. 3, литер А

ulitsa Pogodinskaya 10 build. 8, Moscow 119121

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича; Объединённый институт высоких температур Российской академии наукРоссияInstitute of Biomedical Chemistry; Joint Institute for High Temperatures of the Russian Academy of SciencesRussian FederationНаучно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. ОреховичаРоссияInstitute of Biomedical ChemistryRussian FederationСанкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж. И. Алфёрова Российской академии наукРоссияAlferov Federal State Budgetary Institution of Higher Education and Science Saint Petersburg National Research Academic University of the Russian Academy of SciencesRussian Federation202401062024012032Copyright © Иванов Ю.Д., Аблеев А.Н., Шумянцева В.В., Жданов Д.Д., Покровская М.В., Александрова С.С., Иванова И.А., Виноградова А.В., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С., Ваулин Н.В., Лебедев Д.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Арчаков А.И., 20242024Иванов Ю.Д., Аблеев А.Н., Шумянцева В.В., Жданов Д.Д., Покровская М.В., Александрова С.С., Иванова И.А., Виноградова А.В., Неведрова Е.Д., Зиборов В.С., Ваулин Н.В., Лебедев Д.В., Букатин А.С., Мухин И.С., Арчаков А.И.Ivanov Y., Ableev A., Shumyantseva V., Zhdanov D., Pokrovskaya M., Aleksandrova S., Ivanova I., Vinogradova A., Nevedrova E., Ziborov V., Vaulin N., Lebedev D., Bukatin A., Mukhin I., Archakov A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.physmathmgou.ru/jour/article/view/620Цель

Цель. Изучить возможность использования нанопор для мониторинга функционирования аспарагиназы.

Процедура и методы

Процедура и методы. В работе была сконструирована нанопора на базе SiN, в которую встраивали молекулу L-аспарагиназы. Мониторинг каталитической активности встроенной в нанопору единичной молекулы L-аспарагиназы осуществляли, наблюдая за изменением ионного тока в ячейке с этой нанопорой. Этот подход полезен для исследования каталитической активности на базе встроенных в нанопору единичных молекул ферментов.

Результаты

Результаты. Был создан нанопоровый детектор для исследования активности аспарагиназы. Было получено, что этот детектор позволял проводить мониторинг активности этого фермента в реальном времени без использования меток.

Теоретическая и/или практическая значимость. Показано, что нанопоровый детектор, с размером нанопоры порядка 6 нм, может быть использован для исследования активности аспарагиназы. При этом возможно проводить в реальном времени контроль изменения формы аспарагиназы, который заключается в контроле изменения тока проводимости, проходящего через нанопору, в котором была иммобилизована аспарагиназа. Полученные результаты могут быть полезны при анализе работы ферментов на уровне единичных молекул с помощью нанопорового детектора.

Aim

Aim. The possibility of using a nanopore to monitor the functioning of asparaginase has been studied.

Methodology

Methodology. In this work, a SiN-based nanopore was constructed in which the L-asparaginase molecule was embedded. The catalytic activity of the L-asparaginase molecule, embedded in the nanopore, has been monitored by observing the change in the ion current in the cell with this nanopore. This approach is useful for studying the catalytic activity based on single enzyme molecules embedded in a nanopore.

Results

Results. A nanopore detector for studying the catalytic activity of L-asparaginase has been developed. It has been found that this detector made it possible to monitor the activity of this enzyme.

Research implications

Research implications. It has been shown that a nanopore detector, with a nanopore size of the order of 6 nm, can be used to study the activity of asparaginase. It is possible to carry out realtime monitoring of changes in the form of L-asparaginase, which consisted in monitoring changes in the ion current passing through a nanopore, in which asparaginase was immobilized. The results obtained can be of use in the analysis of the functioning of enzymes at the level of single molecules. 

нанопорааспарагиназааспарагинкаталитическая активностьnanoporeasparaginaseasparaginecatalytic activityРабота выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№ 122030100168-2). Авторы выражают благодарность ОИВТ РАН за подготовку образцов. Работа по подготовке образцов была финансово поддержана за счёт субсидий на выполнение государственного задания № 075-01056-22-02.The work was carried out within the framework of the Program for Basic Scientific Research in the Russian Federation for the long-term period (2021–2030) (No. 122030100168-2). The authors express their gratitude to the Joint Institute for High Temperatures of the Russian Academy of Sciences for preparing the samples. The sample preparation work was financially supported by subsidies for the implementation of state assignment No. 075-01056-22-02.ReferencesL-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent / Verma N., Kumar K., Kaur G., Anand S. // Critical reviews in biotechnology. 2007. Vol. 27. Iss. 1. P. 45–62. DOI: 10.1080/07388550601173926.Verma N., Kumar K., Kaur G., Anand S. L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. In: Critical reviews in biotechnology, 2007, vol. 27, iss. 1, pp. 45–62. DOI: 10.1080/07388550601173926.L-asparaginase / Whitecar J. P. Jr, Bodey G. P., Harris J. E., Freireich E. J. // The New England Journal of Medicine. 1970. Vol. 282. No. 13. P. 732–734. DOI: 10.1056/NEJM197003262821307.Whitecar J. P. Jr, Bodey G. P., Harris J. E., Freireich E. J. L-asparaginase. In: The New England Journal of Medicine, 1970, vol. 282, no. 13, pp. 732–734. DOI: 10.1056/NEJM197003262821307.Kozak M., Jurga S. A comparison between the crystal and solution structures of Escherichia coli asparaginase II // Acta Biochimica Polonica. 2002. Vol. 49. No. 2. P. 509–513.Kozak M., Jurga S. A comparison between the crystal and solution structures of Escherichia coli asparaginase II. In: Acta Biochimica Polonica, 2002, vol. 49, no. 2, pp. 509–513.Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy / Swain A. L., Jaskólski M, Housset D, Rao J. K, Wlodawer A. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1993. Vol. 90. no. 4. P. 1474–1478. DOI: 10.1073/pnas.90.4.1474.Swain A. L., Jaskólski M, Housset D, Rao J. K, Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. In: Proceedings of the National Academy of Sciences, 1993, vol. 90, no. 4, pp. 1474–1478. DOI: 10.1073/pnas.90.4.1474.A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: Crystal structure of a Thr‐89‐Val mutant / Palm G. J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Röhm K. H., Wlodawer A. // FEBS Letters. 1996. Vol. 390. No. 2. P. 211–216. DOI: 10.1016/0014-5793(96)00660-6.Palm G. J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Röhm K. H., Wlodawer A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: Crystal structure of a Thr‐89‐ Val mutant. In: FEBS Letters, 1996, vol. 390, no. 2, pp. 211–216. DOI: 10.1016/0014-5793(96)00660-6.Исследование вторичной структуры L-аспарагиназы в широком интервале значений рН / Илларионова И. Г., Петров Л. И., Олейникова Л. В., Рощин С. Н., Пасечник В. А., Халяпин Б. Д., Полоцкий А. Е., Воинова Н. Е., Штукина Т. Б. // Молекулярная Биология. 1980. Т. 14. № 4. С. 951–955.Illarionova I. G., Petrov L. I., Oleynikova L. V., Roshchin S. N., Pasechnik V. A., Khalyapin B. D., Polotskiy A. Ye., Voinova N. Ye., Shtukina T. B. [Study of the secondary structure of L-asparaginase in a wide range of pH values]. In: Molekulyarnaya Biologiya [Molecular Biology], 1980, vol. 14, no. 4, pp. 951–955.АСМ-визуализация, измерение активности и физико-химических свойств единичных мономеров и олигомеров ферментов / Иванов Ю. Д. Бухарина Н. С., Плешакова Т. О., Французов П. А., Крохин Н. В., Зиборов В. С., Арчаков А. И. // Биофизика. 2011. Т. 56. № 5. С. 939–944.Ivanov Yu. D. Bukharina N. S., Pleshakova T. O., Frantsuzov P. A., Krokhin N. V., Ziborov V. S., Archakov A. I. [Atomic force microscopy visualization and measurement of the activity and physicochemical properties of single monomeric and oligomeric enzymes]. In: Biofizika [Biophysics], 2011, vol. 56, no. 5, pp. 939–944.АСН-нанотехнология для визуализации, счёта, определения упругости и активности единичных белков цитохром Р 450-содержащих монооксигеназных систем / Иванов Ю. Д., Бухарина Н. С., Французов П. А., Плешакова Т. О., Мунро А. В., Хуэй Бон Хоа Г., Арчаков А. И. // Нанотехнологии и охрана здоровья. 2010. Т. 2. № 1. С. 30– 35.Ivanov Yu. D., Bukharina N. S., Frantsuzov P. A., Pleshakova T. O., Munro A. V., Hui Bon Hoa G., Archakov A. I. [ASN nanotechnology for visualization, counting, determination of elasticity and activity of single proteins of cytochrome P 450-containing monooxygenase systems]. In: Nanotekhnologii i okhrana zdorov'ya [Nanotechnologies and health care], 2010, vol. 2, no. 1, pp. 30–35.Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope / Radmacher M., Fritz M., Hansma H. G., Hansma P. K. // Science. 1994. Vol. 265. No. 5178. P. 1577–1579. DOI: 10.1126/science.8079171.Radmacher M., Fritz M., Hansma H. G., Hansma P. K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. In: Science, 1994, vol. 265, no. 5178, pp. 1577– 1579. DOI: 10.1126/science.8079171.A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates / Pham B., Eron S. J., Hill M. E., Li X., Fahie M. A., Hardy J. A., Chen M. // Biophysical Journal. 2019. Vol. 117. No. 5. P. 844–855. DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.045.Pham B., Eron S. J., Hill M. E., Li X., Fahie M. A., Hardy J. A., Chen M. A nanopore approach for analysis of caspase-7 activity in cell lysates. In: Biophysical Journal, 2019, vol. 117, no. 5, pp. 844–855. DOI: 10.1016/j.bpj.2019.07.045.Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis / Wang L., Han Y., Zhou S., Guan X. // Biosensors and Bioelectronics. 2014. Vol. 62. P. 158– 162. DOI: 10.1016/j.bios.2014.06.041.Wang L., Han Y., Zhou S., Guan X. Real-time label-free measurement of HIV-1 protease activity by nanopore analysis. In: Biosensors and Bioelectronics, 2014, vol. 62, pp. 158–162. DOI: 10.1016/j.bios.2014.06.041.Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity / Zhou S., Wang L., Chen X, Guan X. // ACS Sensors. 2016. Vol. 1. No. 5. P. 607–613. DOI: 10.1021/acssensors.6b00043.Zhou S., Wang L., Chen X, Guan X. Label-free nanopore single-molecule measurement of trypsin activity. In: ACS Sensors, 2016, vol. 1, no. 5, pp. 607–613. DOI: 10.1021/acssensors.6b00043.Kukwikila M., Howorka S. Nanopore-based electrical and label-free sensing of enzyme activity in blood serum // Analytical Chemistry. 2015. Vol. 87. No. 18. P. 9149–9154. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b01764.Kukwikila M., Howorka S. Nanopore-based electrical and label-free sensing of enzyme activity in blood serum. In: Analytical Chemistry, 2015, vol. 87, no. 18, pp. 9149–9154. DOI: 10.1021/acs.analchem.5b01764.Translocation of double-stranded DNA through membrane-adapted phi29 motor protein nanopores / Wendell D., Jing P., Geng J., Subramaniam V., Lee T. J., Montemagno C., Guo P. // Nature Nanotechnology. 2009. Vol. 4. No. 11. P. 765–772. DOI: 10.1038/nnano.2009.259.Wendell D., Jing P., Geng J., Subramaniam V., Lee T. J., Montemagno C., Guo P. Translocation of double-stranded DNA through membrane-adapted phi29 motor protein nanopores. In: Nature Nanotechnology, 2009, vol. 4, no. 11, pp. 765–772. DOI: 10.1038/nnano.2009.259.An engineered ClyA nanopore detects folded target proteins by selective external association and pore entry / Soskine M., Biesemans A., Moeyaert B., Cheley S., Bayley H., Maglia G. // Nano letters. 2012. Vol. 12. No. 9. P. 4895–4900. DOI: 10.1021/nl3024438.Soskine M., Biesemans A., Moeyaert B., Cheley S., Bayley H., Maglia G. An engineered ClyA nanopore detects folded target proteins by selective external association and pore entry. In: Nano letters, 2012, vol. 12, no. 9, pp. 4895–4900. DOI: 10.1021/nl3024438.Ion-beam sculpting at nanometre length scales / Li J., Stein D., McMullan C., Branton D. Aziz M. J., Golovchenko J. A. // Nature. 2001. Vol. 412. No. 6843. P. 166–169. DOI: 10.1038/35084037.Li J., Stein D., McMullan C., Branton D. Aziz M. J., Golovchenko J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. In: Nature, 2001, vol. 412, no. 6843, pp. 166–169. DOI: 10.1038/35084037.Kwok H., Briggs K., Tabard-Cossa V. Nanopore fabrication by controlled dielectric breakdown // PLOS ONE. 2014. Vol. 9. Iss. 3. P. e92880. DOI: 10.1371/journal.pone.0092880.Kwok H., Briggs K., Tabard-Cossa V. Nanopore fabrication by controlled dielectric breakdown. In: PLOS ONE, 2014, vol. 9, iss. 3, pp. e92880. DOI: 10.1371/journal.pone.0092880.Solid-state nanopore fabrication by automated controlled breakdown / Waugh M., Briggs K., Gunn D., Gibeault M., King S., Ingram Q., Jimenez A. M., Berryman S., Lomovtsev D., Andrzejewski L., Tabard-Cossa V. // Nature Protocols. 2020. Vol. 15. No. 1. P. 122–143. DOI: 10.1038/s41596-019-0255-2.Waugh M., Briggs K., Gunn D., Gibeault M., King S., Ingram Q., Jimenez A. M., Berryman S., Lomovtsev D., Andrzejewski L., Tabard-Cossa V. Solid-state nanopore fabrication by automated controlled breakdown. In: Nature Protocols, 2020, vol. 15, no. 1, pp. 122–143. DOI: 10.1038/s41596-019-0255-2.Ionic field effect transistors with sub-10 nm multiple nanopores / Nam S.-W., Rooks M. J., Kim K.-B., Rossnagel S. M. // Nano letters. 2009. Vol. 9. No. 5. P. 2044–2048. DOI: 10.1021/nl900309s.Nam S.-W., Rooks M. J., Kim K.-B., Rossnagel S. M. Ionic field effect transistors with sub10 nm multiple nanopores. In: Nano letters, 2009, vol. 9, no. 5, pp. 2044–2048. DOI: 10.1021/nl900309s.Structural and functional insights into Erwinia carotovora l‐asparaginase / Papageorgiou A. C., Posypanova G. A., Andersson C. S., Sokolov N. N., Krasotkina J. // The FEBS Journal. 2008. Vol. 275. Iss. 17. P. 4306–4316.Papageorgiou A. C., Posypanova G. A., Andersson C. S., Sokolov N. N., Krasotkina J. Structural and functional insights into Erwinia carotovora L-asparaginase. In: The FEBS Journal, 2008, vol. 275, iss. 17, pp. 4306–4316.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.